Для количественного определения содержания вакцинного антигена в вакцине клещевого энцефалита, на предприятии НПО «Вирион» (филиал «НПО «Микроген») разработан стандартный образец предприятия (СОП) вакцинного антигена вируса КЭ. СОП аттестован в соответствии с требованиями стандартизации, и калиброван по содержанию протективного белка Е. Показана принципиальная возможность определения содержания вакцинного антигена в вакцине КЭ на примере нескольких серий вакцины «Энцевир».
Клещевой энцефалит представляет одну из наиболее серьезных проблем инфекционной патологии в РФ. Несмотря на принимаемые меры, заболеваемость КЭ в РФ высока — от 2000 до 3000 больных в год. Одним из эффективных средств борьбы с остается профилактическая прививка от клещевого энцефалита населения, проживающего в регионах его природных очагов [1, 2].
В настоящее время в РФ зарегистрированы шесть вариантов вакцины КЭ: две отечественные (для взрослых и детей с 3-летнего возраста) — вакцина КЭ производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», вакцина «Энцевир» производства ФГУП «НПО «Микроген»; и четыре зарубежные – «ФСМЕ-Иммун» (для взрослых и подростков с 16 лет), «ФСМЕ-Иммун–Джуниор» (для детей с 1 года и до 16 лет) — обе производства компании «Бакстер–вакцины», Австрия; «Энцепур взрослый» (для взрослых и подростков с 12 лет), «Энцепур детский» (для детей с 1 года и до 12 лет) — обе производства компании «Новартис–вакцины», Германия.
Таблица 1. Специфическая активность вакцин от клещевого энцефалита по результатам изучения иммуногенной активности на мышах Бальб/С с 2006 по 2010 г.
Название вакцины | Количество серий отконтролированных в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» | МИД50 (среднее значение), мл | Диапазон МИД50, мл |
«Энцевир» | 25 | 0,0043 |
от 0,0011 до 0,0125 |
Вакцина ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН» | 22 | 0,0052 |
от 0,001 до 0,0122 |
«ФСМЕ-Иммун» | 8 | 0,0028 |
от 0,001 до 0,006 |
«Энцепур» | 6 | 0,036 |
от 0,019 до 0,05 |
Примечание: МИД50 — минимальная иммунизирующая доза вакцины; лимит МИД50 по НД: ≤ 0,0125 мл.
Основным показателем качества вакцин КЭ является специфическая активность, определенная в тесте иммуногенности на линейных мышах Балб/С. Сравнительный анализ специфической (иммуногенной) активности при контроле вышеуказанных вакцин в стандартном тесте показывает, что вакцины отечественного производства и вакцины производства компании «Бакстер-вакцины», имеют сходные показатели иммуногенности по МИД50 (минимальная 50% иммунизирующая доза). МИД50 для вакцин компании «Новартис вакцины» выше лимита в 3–5 раз (табл. 1).
Содержание в вакцине вирусного антигена (протективного белка Е) должно быть стандартным. Избыточное содержание вакцинного вирусного антигена может повысить реактогенность вакцины, выражающуюся в появлении температурных реакций от 38°С и выше, головной боли, общем недомогании. Эти явления наблюдаются, как правило, после первой прививки, реже после второй прививки, через 7-8 ч после введения вакцины и проходят на следующий день [3, 4].
Вакцины зарубежного производства: «ФСМЕ-Иммун» (взрослая и детская), «Энцепур» (взрослая и детская) — калиброваны по этому показателю: «ФСМЕ-Иммун» — взрослая — 2,38 мкг/0,5 мл, детская — 1,6 мкг/0,25 мл, «Энцепур взрослый» — 1,5 мкг/0,5 мл, детский — 0,75 мкг/0,25 мл. Данные показатели указаны в инструкциях по применению на эти вакцины. Подбор оптимальной дозы вакцинного антигена проводился при достаточно больших доклинических и клинических исследованиях [2].
Таблица 2. Сравнительное определение титра вакцинного антигена вируса КЭ методом ИФА
№ серий вакцины «Энцевир» | Набор реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ», титр в ИФА вакцинного антигена ВКЭ | Набор реагентов «ВектоВКЭ-Антиген», титр в ИФА вакцинного антигена ВКЭ |
360409 | 1:256 | 1:2560 |
400609 | 1:256 | 1:1280 |
480809 | 1:256 | 1:1280 |
611209 | 1:256 | 1:5120 |
620110 | 1:256 | 1:2560 |
700110 | 1:512 | 1:5120 |
740210 | 1:512 | 1:5120 |
750210 | 1:512 | 1:1280 |
760310 | 1:512 | 1:2560 |
770310 | 1:512 | 1:1280 |
Примечания: «ВектоВКЭ-антиген» — производства ЗАО «ВекторБест»; «ИФА ТС АГ ВКЭ» — производства ФГУП «НПО «Микроген».
Отечественные вакцины КЭ по показателю содержания вакцинного вирусного антигена в прививочной дозе не стандартизованы. В связи с этим, целью нашего исследования стала разработка и стандартизация способа количественного определения содержания вакцинного вирусного антигена в вакцине КЭ.
В качестве модели была использована вакцина КЭ «Энцевир», производства ФГУП «НПО «Микроген». Исследования проводились параллельно в ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России и в НПО «Вирион» – филиале ФГУП «НПО «Микроген» в Томске.
I. Материалы и методы
Материалы:
- Серии вакцины КЭ «Энцевир» производства ФГУП «НПО Микроген».
- СОП (стандартный образец предприятия) — приготовлен на предприятии НПО «Вирион» согласно рекомендациям ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» для определения вакцинного антигена.
- Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ВектоВКЭ-антиген», производства ЗАО «Вектор–Бест», Новоси бирск.
- Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антигена вируса КЭ «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО «Микроген».
- Препарат протективного белка Е вируса КЭ — очищенный жидкий белок Е, партия № 41, с концентрацией белка Е — 160 мкг/мл. Получен из ЗАО «Вектор–Бест». Хранение при температуре минус 70°С.
Методы:
- Иммуноферментный анализ.
- Стандартный тест определения специфической активности (иммуногенности) вакцин КЭ при иммунизации линейных мышей Балб/С.
- Компьютерная программа статистической обработки результатов иммуноферментного анализа методом параллельных линий «Паралайн», разработана докт. биол. наук. В.Г. Петуховым в ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России [5].
II. Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ чувствительности двух наборов реагентов для ИФА при титровании серий вакцин Энцевир» проводился следующим образом.
В предварительных опытах нами была установлена озможность титрования сорбированных вакцин КЭ методом ИФА в наборах реагентов для выявления вакцинного антигена вируса клещевого энцефалита: «ВектоВКЭ-антиген», производства ЗАО «ВекторБест» и «ИФА ТС АГ ВКЭ» производства ФГУП «НПО «Микроген». Наборы реагентов различаются по составу основных реагентов: в первом наборе для выявления антигена вируса КЭ используются только моноклональные антитела к белку Е, штамм № 205 вируса КЭ (как в иммуносорбенте, так и в конъюгате). Во втором наборе реагентов для этой цели используются поликлональные антитела, полученные на основе асцитической жидкости крыс, иммунизированных вирусом КЭ.
Таблица 3. Сравнительное титрование методом ИФА препарата белка Е вируса КЭ и СОП вакцинного антигена
Дата постановки опыта в ИФА | Набор реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ» | Набор реагентов «ВектоВКЭ-антиген» | ||
Белок Е № 41 | СОП | Белок Е № 41 | СОП | |
8.11.2010 | 1:10240 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 |
10.11.2010 | 1:20480 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 |
26.11.2010 | 1:10240 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 |
1.12.2010 | 1:10240 | 1:1024 | — | 1:8000 |
3.12.2010 | 1:10240 | 1:512 | 1:128000 | 1:8000 |
4.12.2010 | 1:20480 | 1:512 | 1:128000 | 1:8000 |
1:20480 | 1:512 | 1:128000 | 1:8000 | |
7.12.2010 | 1:10240 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 |
1:10240 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 | |
8.12.2010 | 1:10240 | 1:1024 | 1:128000 | 1:8000 |
1:10240 | 1:1024 | 1:64000 | 1:8000 | |
9.12.2010 | 1:10240 | 1:1024 | 1:64000 | 1:8000 |
10.12.2010 | — | — | 1:64000 | 1:8000 |
Нами проведено титрование 10 серий вакцины от клещевого энцефалита «Энцевир» в обоих наборах реагентов. Каждая серия вакцины исследовалась в ИФА не менее трех раз. Полученные данные показывают более чем 10-кратное превышение титров антигена при использовании набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» (табл. 2).
В табл. 3 представлены результаты параллельного титрования методом ИФА в обоих наборах реагентов (10 опытов) препарата протективного белка Е вируса КЭ и СОП вакцинного антигена, выполненные в НПО «Вирион». Они подтвердили более высокую чувствительность набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» по сравнению с набором реагентов «ИФА ТС АГ ВКЭ».
Таблица 4. Сравнительные данные по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ
№ препарата | Наименование показателя | НПО «Вирион» | «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» |
1 | Внешний вид | Пористая масса белого цвета | |
2 | Точность, % розлива | 2,0 | 1,35 |
3 | Потеря в массе при высушивании, % | 2,2 | 2,3 |
4 | Герметичность | герметичен | герметичен |
5 | рН | 7,42 | 7,4 |
6 | Содержание общего белка (мкг/ампула) | 13,0-14,0 | 13,3 |
7 | Содержание сахарозы (мкг/ампула) | 26,4 | 25,0 |
8 | Средняя масса содержимого (мкг/ампула) | 35,18 | 34,8 |
9 | Иммуногенность (МИД50 в мл) | 0,002 | 0,001 |
10 | Специфическая активность (титр в ИФА) | 1:1024** |
1:4096* 1:8192* |
Примечания: НПО «Вирион», г. Томск — тест система «ИФА ТС АГ ВКЭ», сер. № 020310. «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» — набор реагентов «ВектоВКЭ–аниген» ЗАО «Вектор – Бест», г. Новосибирск.
Таблица 5. Изучение стабильности СОП в тесте термодеградации (температура 37°С в течение 7 и 14 сут)
Разведения СОП (исх.1:32) | Титрование СОП, ампула № 1 | Титрование СОП, ампула № 2 | Титрование СОП после теста термодеградации (7 суток) | Титрование СОП после теста термодеградации (14 суток) |
1:256 | 3,398 | 3,237 | — | 3,455 |
1:512 | 2,586 | 2,154 | 2,612 | 2,364 |
1:1024 | 1,367 | 1,129 | 1,398 | 1,230 |
1:2048 | 0,738 | 0,612 | 0,673 | 0,684 |
1:4096 | 0,385 | 0,288 | 0,396 | 0,339 |
Примечания: даны значения оптической плотности (ОП) каждого разведения СОП.
Таблица 6. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцинного антигена (статистическая обработка в программе «Паралайн» результатов титрования в ИФА — данные «ГИСК им. Л.А. Тарасевича»)
Исследование СОП/белок Е | Min стандартное отклонение | Концентрация белка Е, мкг/0,5мл | Max стандартное отклонение |
Ампула № 1 | 8,46 | 9,19 | 9,9 |
Ампула № 2 | 7,53 | 9,66 | 12,4 |
Ампула № 3 | 8,22 | 8,92 | 9,67 |
Среднее значение | 8,1 | 9,26 | 10,33 |
Таблица 7. Определение концентрации вирусного белка Е в СОП вакцины КЭ (данные «НПО «Вирион»)
Количество измерений* | Содержание вирусного белка Е в СОП (мкг/0,5 мл) |
№ 1 | 8,36 |
№ 2 | 8,17 |
№ 3 | 8,83 |
№ 4 | 7,80 |
№ 5 | 9,15 |
Среднее значение | 8,46 |
* В каждом измерении исследовали по 1 ампуле.
Таблица 8. Определение концентрации вакцинного антигена (белок Е) в сериях вакцины КЭ «Энцевир» по отношению к СОП антигена (с помощью программы «Паралайн»)
Номера серии вакцин «Энцевир» | Min отклонение | Концентрация, мкг/амп | Max отклонение | Номера серии вакцин «Энцевир» | Min отклонение | Концентрация, мкг/амп | Max отклонение |
Сер. 91 | 2,78 | 3,29 | 3,84 | Сер. 71 | 4,00 | 4,77 | 5,66 |
Сер. 93 | 2,22 | 2,85 | 3,52 | Сер. 72 | 3,18 | 3,83 | 4,53 |
Сер. 90 | 1,92 | 2,49 | 3,21 | Сер. 75 | 4,48 | 5,35 | 6,39 |
Сер. 95 | 2,67 | 3,34 | 4,05 | Сер. 77 | 4,74 | 5,70 | 6,92 |
Среднее значение | 2,39 | 2,99 | 3,66 | Среднее значение | 4,1 | 4,91 | 5,88 |
Для получения кандидата в СОП нами использована технология производства серийной продукции очищенной и концентрированной вакцины КЭ «Энцевир». СОП готовили на основе полуфабриката вакцины без добавления стабилизатора (альбумин крови человека) и проведения сорбции антигена на геле алюминия гидроксида. Кандидат в СОП вакцинного антигена вируса КЭ серия № 010810 был приготовлен на основе производственной партии очищенного концентрата № 252 культурального антигена вируса КЭ (производственная партия № 252 вошла в серию вакцины «Энцевир» № 103).
К концентрату культурального вакцинного антигена вируса КЭ № 252 был добавлен в качестве стабилизатора раствор сахарозы 50% (из расчета 50 мг сахарозы на 1 мл концентрата). Материал разлит в ампулы по 0,5 мл и лиофилизирован. Всего было получено 736 ампул, дата изготовления — август 2010 г.
В НПО «Вирион» были проведены испытания кандидата СОП по следующим показателям: внешний вид, точность розлива, потеря в массе при высушивании, герметичность, растворимость, прозрачность и цветность растворенного препарата, рН, содержание общего белка, содержание сахарозы, специфическая активность в ИФА, иммуногенность при иммунизации мышей Бальб/С. Для изучения стабильности и определения срока годности СОП, ампулы были заложены на хранение в течение 1 года при различных температурных режимах. После поступления образцов СОП в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» проведена аттестация образцов по тем же показателям. Сравнительные данные по контролю в НПО «Вирион» и аттестации в «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» СОП вакцинного антигена вируса КЭ представлены в табл. 4.
СОП, серия №010810, дополнительно изучен в тесте термодеградации, заключающемся в прогревании образцов СОП при температуре 37oС в течение 7 и 14 сут. Специфическую активность в ИФА образцов СОП после теста термодеградации изучали в сравнении с образцом СОП, хранившимся при температуре от 2 до 8°С. Полученные данные представлены в табл. 5. В результате проведенных исследований СОП вакцинного антигена в ИФА снижения активности не наблюдали. По результатам контроля и аттестации серия СОП № 010810 соответствовала требованиям по всем показателям, на СОП было оформлено Свидетельство и Инструкция по применению.
Определение содержания вирусного белка Е в СОП осуществлялось следующим образом. Основную часть вакцинного антигена вируса КЭ составляет вирусный оболочечный белок Е, обеспечивающий протективные (защитные) свойства вакцины [3].
Очищенный белок Е, партия № 41, был получен из ЗАО «ВекторБест» в сентябре 2010 г. Согласно паспорту на этот препарат, получено 240 мкл с концентрацией белка Е — 160 мкг/мл. Хранение препарата при температуре минус 70oС. Для проведения параллельных титрований СОП и вирусного белка Е готовили предварительное разведение белка Е, основываясь на его исходной концентрации. Разведение 1:1000 готовили на растворе для разведения образцов — РРО из набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген». Таким же образом готовили предварительное разведение СОП — 1:128.
Дальнейшие разведения СОП и белка Е готовили также на растворе РРО. В каждом конкретном случае последовательные двукратные разведения готовились из предварительных разведений. Расчет концентрации белка Е в СОП проведен на основе параллельного титрования трех ампул СОП на разных планшетах набора реагентов «ВектоВКЭ-антиген» в разное время.
Для статистической обработки данных, полученных при параллельном титровании вирусного белка Е и СОП, подбирали для этих материалов разведения, имеющие сравнимые показатели оптической плотности (ОП) с линейным падением их значений. По полученным цифровым показателям ОП проводили статистическую обработку методом параллельных линий программы «Паралайн». Устанавливали линейность и параллельность графиков зависимости логарифма дозы от логарифма ОП для вирусного белка Е в СОП, и рассчитывали концентрацию вакцинного антигена (белка Е) в мкг/мл по формуле:
C = M x C x k,
где С — концентрация вирусного белка Е в СОП в мкг/мл; М — активность вирусного белка Е, установленная по программе «Паралайн»; Сs — концентрация вирусного белка Е в соответствующем разведении; k — коэффициент (разведение СОП 1:2048).
Границы 95% доверительного интервала для рассчитанной концентрации С вычисляли по формулам:
Cmin (минимальное отклонение) = Mminx Csx k
и Cmax (максимальное отклонение) = Mmax x Cs x k.
В программу «Паралайн» для вычисления значения М вносили следующие данные: Сs — концентрация белка Е (разведение 1:16000) = 0,01 мкг/мл; К — разведение испытуемого препарата СОП 1:2048; М — вычисляется автоматически по компьютерной программе Паралайн. В соответствии с данными программы «Паралайн» значение М (активность вирусного белка Е) — 0,943 при значениях: min (минимальное стандартное отклонение) — 0,735 и max — (максимальное стандартное отклонение) — 1,213.
С = 0,943 x 0,01 x 2048 = 19,31 мкг/мл;
Сmin = 0,740 x 0,01 x 2048 = 15,15 мкг/мл;
Сmax = 1,21 x 0,01 x 2048 = 24,78 мкг/мл.
В результате проведенных статистических исследований установлено, что среднее значение содержания вирусного белка Е в СОП составило 9,26 мкг/0,5 мл (табл. 6). Подобные результаты были получены в НПО «Вирион» — содержание белка Е в СОП составило 8,46 мкг/0,5 мл (табл. 7).
Установленная концентрация белка Е в СОП вакцинного антигена вируса КЭ позволила подойти к определению содержания протективного антигена (вирусного белка Е) в сериях вакцины КЭ «Энцевир». Для изучения были подобраны 8 серий вакцины:
- серии № 71, № 72, № 75, № 77: содержание общего белка — от 9,0 мкг/0,5 мл до 9,5 мкг/0,5 мл;
- серии № 90, № 91, № 93, № 95: содержание общего белка — от 5,0 мкг/0,5 мл до 6,0 мкг/0,5 мл.
Проведено параллельное титрование серий вакцины «Энцевир» по отношению к СОП вакцинного антигена вируса КЭ. Титрование каждой серии вакцины «Энцевир» методом ИФА проводилось не менее 3 раз. Показано, что в сериях вакцины, содержавших при контроле меньшее количество общего белка (№ 90, 91, 93, 95), определялась более низкая концентрация белка Е — 2,99 мкг/амп (среднее значение) по сравнению с сериями № 71, 72, 75, 77 — среднее значение вирусного вакцинного антигена по белку Е — 4,91 мкг/амп (табл. 8).
Выводы:
- Разработан и стандартизован способ количественного определения содержания вакцинного вирусного антигена (белок Е) в вакцине клещевого энцефалита.
- Разработан и аттестован СОП вакцинного антигена вируса КЭ соответствующий требованиям стандартизации к СОП; оформлены свидетельство и инструкция по применению СОП.
- СОП вакцинного антигена вируса КЭ калиброван по содержанию вирусного протективного белка Е.
Литература
- Злобин В.И. Современные проблемы эпидемиологии и профилактики клещевого энцефалита в Российской Федерации // Биопрепараты. — 2004. — № 2 (14). — С. 4–7.
- Кунц К. Австрийский опыт вакцина — вакцинации против клещевого энцефалита // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2004. — № 1. — С. 37–41.
- Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов С.В. Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. — 2007. — № 5. — C. 10–16.
- Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Расщепкина М.П. и др. Оценка качества отечественных иммуноферментных тест-систем для ранней диагностики КЭ // Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» РАМН, 9-10 декабря 2003 г. — М., 2003. — С. 53–54.
- Петухов В.Г., Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «Паралайн», 2006.